انجمن علمی ژنتیک آل طه

از روش FISH برای تشخیص ناهنجاری های کروموزومی مانند حذف ها , مضاعف شدن ها , جابه جایی ها و دیگر تغییرات کروموزومی که در ایجاد بیماری ها نقش دارند استفاده می شود . به کمک این روش بیماری هایی چون سندرم آنجلمن , سندرم داون یا به طور کلی سندرم های ریز حذف و آنیوپلوئیدی ها تشخیص داده می شود. سیتوژنتیک به واسطه ی معرفی هیبرید سازی درجا دوران مولکولی خود را آغاز کرد. هیبرید سازی در جا پروسه ای است که به محققان اجازه می دهد مکان توالی های خاص و مشخصی از DNA را تعیین محل کنند . از زمان اولین آزمایش هیبرید سازی در جا در سال 1969 ( گال و پاردو ) تاکنون روش های متنوعی با حساسیت های بالاتر ابداع شده است به طوری که در اوایل کار از پروب های نشاندار با رادیوایزوتوپ استفاده می شد اما امروزه در اکثر پروسه های هیبرید سازی درجا از پروب های فلورسنت برای detect کردن توالی DNA استفاده می شود که به این روش FISH یا fluoresent in situ hybridization ( هیبرید سازی درجا با فلورسنت) می گویند. در تکنیک FISH از اسید نوکلئیک تک رشته ( DNA که پیوند هیدروژن آن از بین رفته باشد و یا RNA ) استفاده می شود. موفقیت انواع روش های هیبرید سازی درجا وابسته به پایداری جالب توجه DNA است . در تست های ژنتیکی پیش از تولد و قبل از لانه گزینی (PGD) یا preimplantation genetic diagnosis می توان علاوه بر روش های مولکولی چون PCR و تشخیص های مربوط به آن از روش FISH نیز استفاده کرد به این گونه که اسپرم و تخمک را در شرایط آزمایشگاهی لقاح می دهند و سپس سلول تخم حاصل شروع به رشد و تکثیر می کنند حال در مرحله ی 4-8 سلولی می توان یک سلول را برای بررسی های PCR و FISH بیوپسی می شود . سلول برداشته شده در مرحله ی بلاستومر رویانی از لحاظ حذف ها , جابه جایی ها , مضاعف شدن ها در قطعاتی از DNA و یا تعداد کروموزوم ها ( تشخیص آنیوپلوئیدی بودن ) و جنسیت ( با بررسی کروموزوموم X و Y با پروب نشاندار مخصوص خود با رنگی با طول موج معین ) بررسی می شود و در صورت مناسب بودن شرایط و نبود اختلال ژنتیکی در سلول مورد بررسی , می توان سلول های دیگر رویان را به رحم مادر inject کرد. از آنجا که روش FISH بررسی کروموزوم در مراحل متافازی می باشد , سلول ها را توسط افزودن مهار کننده ی کلچی سین در مرحله ی متافازی متوقف می کنند . سلول مورد بررسی باید بر روی لام میکروسکوپی فیکس شوند و سپس بر روی کروموزوم های متافازی دناتوره شدن اعمال می شود . بر اساس روش های مختلفی پروب ها یا توالی های الیگوی نوکلئوتیدی مکمل توالی مورد بررسی نشاندار شده با مواد فلورسنت دارای طول موج فلورسنت متفاوت تهیه می شوند و با دناتوره شدن قطعات DNA دو رشته ای به صورت تک رشته در می آیند. پروب خود می تواند توالی مکمل قطعه ای از DNA , یک بازوی کروموزوم و یا کل یک کروموزوم باشد. پروب به لام شیشه ای افزوده می شود و پس از طی زمانی هیبریداسیون پروب با توالی مکمل خود رخ می دهد. بعد از هیبریداسیون مرحله ی شت و شو انجام می شود تا پروب های هیبرید نشده از روی لام خارج شوند. البته در روشی دیگر می توان به منظور تشخیص بسیار سریع و بدون نیاز به سلول های کشت شده از کروموزوم های مرحله ی اینترفاز ( کروماتینی) نیز استفاده کرد. بعد از هیبرید شدن نمونه در معرض طول موج های مختلف متناسب با ماده ی فلورسنت کونژوگه با پروب قرار می گیرد و به این صورت نور فلورسنت ساطع می شودکه به این طریق می توان جایگاه هیبرید شدن را با استفاده ازمیکروسکوپ مشاهده کرد. در مواردی که مضاعف شدن رخ داده باشد شدت سیگنال دریافت شده بیشتر خواهد بود و در عین حال در مواردی که حذف های کروموزومی ( نبود یک کروموزوم به طور کامل و یا نبود قطعه ای از DNA) شدت سیگنال فلورسنت دریافت شده نسبت به حالت طبیعی کاهش می یابد . اگر هر یک از 24 نوع کروموزوم اصلی سلول ( 22 اتوزوم , X و Y ) را با پروب هایی که هر کدام به رنگ های مختلف فلورسنت متصل شده اند در مرحله ی متافازی هیبرید کنیم به حاصل کار که در آن هر نوع کروموزوم به دلیل دارا بودن پروب نشاندار شده به مواد فلورسنت با طول موج های مختلف به رنگ های مختلفی نمایان می شود , کاریوتایپ طیفی یا SKY می گویند.  

به طور معمول کروموزوم ها پس از رنگ آمیزی بزرگنمایی و در زیر میکروسکوپ قابل مشاهده اند. هر کروموزوم دارای الگوی متمایزی از باند های روشن و تاریک است که از ناحیه ی سانترومر به عنوان مبدا به سمت دو انتهای بازو های p و q شماره گذاری می شوند. به واسطه ی مشاهدات تغییر شکل و الگوی باند , کروموزوم ها را بررسی می کنند . اگر تغییرات به میزان کافی بزرگ باشد ( حذف, مضاعف شدگی و... که یک کروموزوم کامل یا بخشی از کروموزوم را شامل شود ) , قابل مشاهده است اما برای بررسی تغییرات کوچک اغلب مهارت بیشتری مورد نیاز است . هرچند برخی از تغییرات آنچنان کوچک اندکه توسط آزمایشات روتین کروموزومی قابل تشخیص نمی باشند اما تکنیک FISH به راحتی امکان تشخیص تغییرات کوچکی را چون ریز حذف ها و مضاعف شدگی هایی که با میکروسکوپ آنالیز کننده قابل تشخیص نیستند , فراهم می کند.همچنین روش FISH برای بررسی تغییرات بزرگ نیز مورد استفاده قرار می گیرد. به طور معمول در تکنیک FISH از دو پروب استفاده می شود . اولین پروب , پروب کنترل است که به منظور شناسایی هر دو کپی از کروموزوم مورد بررسی استفاده می شود. این پروب با توالی که بخش حذفی مورد بررسی را شامل نمی شود , هیبرید شده و سیگنال برای هر دو کروموزوم مشاهده می شود. پروب دوم که مکمل توالی حذف مورد بررسی می باشد با این توالی هیبرید می شود. پس در حذف ها و مضاعف شدن ها میزان سیگنال دریافت شده متفاوت می باشد. حذف ها معمولا در یکی از دو جفت کروموزوم رخ می دهد. پروب ها خود چند نوع اند. برخی از آن ها به بخش های خاصی شامل ژن ها متصل می شوند که به آن ها پروب اختصاصی لوکوس locus-specific probes می گویند. دیگر پروب ها به انتهای بازو های کروموزوم ( تلومر ) و سانترومر(alpoid or centromeric probe) ها متصل می شوند و به منظور شمارش کروموزوم های معین و شناسایی نوآرایی ها به کار برده می شوند. پروب های کروموزوم کامل (whole chromosome probes) نیز نوع دیگری پروب ها می باشند.

تکنیک FISH علاوه بر کاربرد در شناسایی بیماری ها , بدشکلی ها و اختلالات , برای پی گردی منشا سلول ها بعد از پیوند مغز استخوان , مقایسه ی ژنوم دو گونه ی مختلف زیستی به منظور دریافت اطلاعات در خصوص ارتباط و نزدیکی آن ها از لحاظ تکاملی استفاده می شود. تکنیک FISH نیز می تواند همچون بسیاری از روش ها به دو صورت مستقیم ( پروب نشاندار شده با فلورسنت) و غیر مستقیم انجام می شود.

♦️انواع مختلفی از تکنیک های FISH با اهداف متفاوتی ابداع شده است که برخی از آنها به شرح زیر می باشد:

🔶تکنیک ACM-FISH : یک نوع تکنیک FISH مالتی کالر برای ردیابی همزمان تعداد و ساختار ناهنجاری های کروموزومی در سلول های اسپرم می باشد. اختصار ACM به هیبرید سازی همزمان پروب DNA برای سانترومر , 1q12,1p36.3 (ساتلایت های روی کروموزوم ) بر می گردد. برای بررسی اختصاصی حذف ها یا مضاعف شدن ها و همچنین شناسایی شکست های کروموزومی با بررسی 1cen-1q12 تکنیک مناسبی می باشد.

🔶تکنیک arm-FISH: این تکنیک یک multiple FISH یا SKY FISH است که امکان ردیابی ناهنجاری با دقت تفکیک پذیری بازوی کوتاه و بلند همه ی 24 نوع کروموزوم انسانی به جز کروموزوم Y و کروموزوم های آکروسنتریک را فراهم می کند. ابزار مناسبی برای بررسی وارونگی پاراسنتریک می باشد. این روش در آشکار سازی ناپایداری های شایع کروموزومی در تومور ها موفق بوده است.

🔶تکنیک fusion-signal-FISH : در ابتدا برای شناسایی جابه جایی فیلادلفیا ( 9:22) در سلول های مغز استخوان افراد مبتلا به CML برای بررسی روند بهبود بیماری پس از پیوند مغز استخوان ابداع شده

 است. D-FISH یک نوع تقویت یافته ی این روش است و برای بررسی جابه جایی های کروموزومی در بدخیمی های هماتولوژیک می باشد پس از CML یا chronic myeloid leukemia پروب ها به گونه ای ارتقا یافت که جا به جایی ها در بخش های دیگر چون 8:21 برای بررسی میزان بهبود بیماری در افراد مبتلا به AML و همچنین دیگر بیماری هایی چون APL و ALL نیز قابل بررسی شد.

🔶تکنیک PNA-FISH : پپتید نوکلئیک اسید ( PNA ) ها آنالوگ های سنتتیک DNA اند که در آن ها backbone فسفات دئوکسی ریبوز جایگزین یک پپتید بدون بار شده است و به واسطه ی این ساختار بی نظیر هیچ مانع الکترواستاتیکی در حین هیبرید شدن PNA با DNA و RNA وجود ندارد. هیبرید مذکور پایداری بیشتری خواهد داشت و در ابتدا برای سنجش طول تلومر ها در کروموزوم متافازی استفاده می شد اما بعد ها بر روی کروموزوم اینترفازی نیز مورد بررسی قرار گرفت . بدین گونه پروب هایی برای دمین های آلفا ستلایت ها در کروموزوم های خاص طراحی شد. این تکنیک همانگونه که در لنفوسیت ها ، آمنیوسیت ها و فیبروبلاست ها کاربرد موفقی دارند ، در اسپرماتوزوآ ، اووسیت های ایزوله و بلاستومر در تشخیص های غیر تهاجمی پرناتال نیز قابل انجام است. از این روش با ایجاد هیبرید RNA-PNA در تشخیص های غیر تهاجمی پرناتال در شناسایی mRNA گاما گلوبین گلبول های قرمز مورد استفاده قرار گرفته است.